Nat Commun︱卡罗林斯卡医学院发现GIT1抑制乳腺癌生长并可评估患者预后风险

撰文︱张松柏，李 岳

责编︱王思珍 

乳腺癌（breast cancer）是一种高度异质性的恶性肿瘤，可影响多达10% 的女性群体，给社会造成重大医疗负担[1]。根据雌激素受体（estrogen receptor，ER）存在与否，乳腺癌可分为ER（+）型和 ER（−） 型。ER（+）乳腺癌可选择抗雌激素治疗，而ER（−）乳腺癌的治疗选择较少，尤其是三阴性乳腺癌（即雌激素受体、孕激素受体、人表皮生长因子受体-2均呈阴性）。因此，探讨ER（−）乳腺癌相关的分子机制，将为其治疗寻找新的治疗靶点。

Notch信号通路，是一种广泛存在且高度保守的细胞间信号传递机制，也是目前一个有趣的潜在治疗肿瘤靶点[2-6]。位于细胞膜上的Notch配体与相邻细胞的跨膜Notch受体结合后，Notch受体被ADAM金属蛋白酶和γ-分泌酶裂解，释放出Notch受体的胞内结构域（Notch ICD）。Notch ICD转移至细胞核，激活效应基因表达，决定细胞命运。Notch ICD上有四个核定位信号（NLS1-4），其中 NLS3和 NLS4通常被认为是负责Notch ICD的细胞质−细胞核转移[7, 8]。而NLS1和NLS2尚未有关于其功能的报告。

很多研究表明，Notch 信号传导的过度激活与乳腺癌不良预后之间存在关联[9-12]，特别是对于 ER（−）乳腺癌。雌激素信号和 Notch 信号之间存在相互作用[13-15]，ER（−）乳腺癌中的Notch 信号强于ER（+）乳腺癌；雌二醇（oestradiol）抑制 Notch 信号传导 [13]，并改变Notch在细胞内的分布。ER（−）乳腺癌细胞对Notch 抑制剂较敏感[13]，相比ER（+）细胞，ER（−）细胞中的Notch 更多存在于核内[16,17]。然而，与其他类型癌症不同，乳腺癌细胞中虽然经常观察到过度活跃的 Notch 信号，并且与较差预后相关联，但其Notch 信号核心通路中的基因突变相对较少，说明尚有未知的分子机制在调节 Notch活动。为什么ER（−）乳腺癌中Notch信号异常升高？为什么ER（−）乳腺癌中Notch ICD更多位于细胞核内？这些调节机制也尚未完全阐明。

2022年3月22日，瑞典卡罗林斯卡医学院的Per Uhlén实验室在Nature Communications上发表了题为“GIT1 protects against breast cancer growth through negative regulation of Notch”的研究论文。研究发现细胞内普遍存在的，参与多种分子信号通路的一种衔接蛋白GIT1，在ER（−）乳腺癌样本中的表达量与Notch信号强弱呈负相关。GIT1与Notch ICD的NLS1和NLS2结合，从而调节Notch信号通路，抑制ER（−）乳腺癌生长。GIT1可作为ER（−）乳腺癌预后的观测指标。

在这项工作中，作者在此研究为什么 Notch 信号在 ER（−）乳腺癌中异常升高。首先通过免疫组化染色发现，ER（−）乳腺癌标本中GIT1蛋白的表达量低于ER（+）标本，与Notch ICD的表达量相反。蛋白质组学分析也支持这一实验数据。为确定GIT1（即G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1 ）表达量可否评判乳腺癌患者预后，作者用 Kaplan-Meier 法分析了多个数据库。结果揭示，高 GIT1 表达和乳腺癌患者无复发生存率升高之间存在直接相关性。将数据按ER不同状态分类后，这种相关性在ER（−）乳腺癌患者中更加明显，GIT1表达量越高，乳腺癌无复发生存率越高（图1）。

图1 GIT1表达量在ER（−）乳腺癌细胞内的表达量低于ER（+）细胞，且与无复发生存率呈正相关

（图源：Songbai Zhang et al., Nat Commun, 2022）

已有报告指出，ER（−）乳腺癌中Notch活性增强[13, 18]。为了探寻GIT1-Notch之间可能的关系，研究人员通过敲低MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞内GIT1的内源性表达量，来模仿ER（−）乳腺癌细胞中GIT1蛋白量，并用双荧光素酶报告分析系统测定Notch信号通路下游分子活性。结果显示，降低GIT1的内源性表达增加了Notch信号活性，而过表达GIT1则降低Notch信号活性。蛋白质印迹实验也表明，GIT1对Notch信号下游分子Hey1的表达有此种调节作用。

为了探明GIT1如何影响癌细胞的发育生长，研究人员分析了2500多份乳腺癌样本信息，搜索与细胞瘤干性相关的基因，发现GIT1低表达的样本中ALDH1A1（醛脱氢酶1）和CXCR4（C-X-C趋化因子受体4型）的表达量显著增加。作者集中分析了ALDH1和GIT1的关系，有趣的是，乳腺癌患者的ALDH1和GIT1之间存在中度但明显的负相关。实验也进一步证实，敲低 GIT1 在三阴性乳腺癌细胞中的表达，ALDH1阳性细胞数量显著增加，而 GIT1 过表达逆转这种效应。Notch 抑制剂DAPT阻止GIT1此种调节ALDH1阳性细胞数量的能力。集落形成能力是一种与癌症瘤干性密切相关的细胞内在特性。作者的实验显示，敲低三阴性乳腺癌细胞中GIT1表达显著增加癌细胞集落数量，而GIT1过表达则减少此种集落数量，DAPT亦使GIT1失去此种调节癌细胞集落数量的能力（图2）。

图2 GIT1调节Notch信号通路，癌干细胞活力及癌细胞集群形成

（图源：Songbai Zhang et al., Nat Commun, 2022）

接着，为了探寻GIT1-Notch存在何种关联机制，作者进行了免疫共沉淀和GST融合蛋白沉降实验。结果分别表明，GIT1可与γ-分泌酶裂解的Notch ICD相结合了，包含NLS1和 NLS2的Notch多肽片段可充分与GIT1相结合。将NLS1和NLS2同时敲除或点突变，GIT1-Notch结合反应则不再发生，可见NLS1和 NLS2是此结合反应的必要氨基酸部分。GIT1-Notch结合无需借助其它蛋白实现，因为纯化的GIT1也能与纯化的Notch结合（图2）。

图3 GIT1结合于Notch的细胞内多肽片段

（图源：Songbai Zhang et al., Nat Commun, 2022）

Notch信号通路中任何一步的干扰都可以改变Notch下游信号强弱，从而改变细胞命运[2, 5]。为了探讨GIT1如何影响Notch 信号，作者进行了乳腺癌细胞亚细胞蛋白分离试验，发现GIT1改变Notch ICD的细胞内分布。敲低GIT1表达减少了细胞质内Notch ICD的分布量，相应地增加了细胞核内Notch ICD的分布量。过表达GIT1则得到相反的结果。将不能与GIT1发生结合反应、含有NLS1和 NLS2点突变且连接于绿色荧光蛋白的Notch ICD的质粒转染到细胞中，相对于未点突变的Notch ICD，点突变的Notch ICD展现了较强的细胞核内荧光分布。

作者进一步采用双荧光素酶报告分析系统，来验证Notch ICD的这种细胞质-细胞核分布变化。结果显示，敲低GIT1蛋白表达增加了Notch ICD的细胞核内活性，过表达GIT1蛋白则对应地降低Notch ICD的细胞核内活性。NLS1和 NLS2点突变也显著增强细胞核内荧光素酶活性报告（图4）。

             图4 GIT1调节细胞内Notch ICD的分布

（图源：Songbai Zhang et al., Nat Commun, 2022）

文章最后，为了确定GIT1-Notch的关联作用是否影响肿瘤发生，研究团队将两种基因修饰过的三阴性乳腺癌细胞异种移植到免疫缺陷小鼠的皮下。令人兴奋的是，GIT1过表达显著减缓小鼠体内肿瘤形成，而降低GIT1表达则加速肿瘤形成及生长。生长曲线也显示GIT1敲低和过表达对肿瘤增长速率有极大影响。相对应地，GIT1低表达的肿瘤内ALDH1阳性细胞数量显著高于对照组。免疫染色和流式细胞术实验分别揭示GIT1低表达肿瘤的细胞核内Notch ICD和Hey1水平都相对增加。为进一步评估GIT1低表达肿瘤的生长加速度是否是由Notch 信号改变所致，研究团队在肿瘤细胞中转染了一种可阻止Notch ICD下游通路、从而充当Notch信号负调节器的显性负突变体质粒：DNMM1。结果发现，在异种肿瘤移植的小鼠中，DNMM1显著减缓GIT1低表达对肿瘤生长的促进作用，也明显降低肿瘤中ALDH1阳性和Hey1阳性细胞的数量。这些数据表明：高水平GIT1可减弱Notch 信号，阻止肿瘤发育生长；而GIT1丢失则增强Notch信号，加速肿瘤形成（图5）。

   图5 GIT1抑制动物体内三阴性乳腺癌形成

（图源：Songbai Zhang et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究通过传统分子生物学手段结合生物信息分析、动物实验等方法，发现GIT1是ER（−）乳腺肿瘤细胞中与Notch相互作用的蛋白，GIT1直接与Notch ICD结合，从而调节其进入乳腺肿瘤细胞核内的过程。敲低GIT1表达量提高ER（−）乳腺癌细胞中Notch 活性，并增加ALDH1阳性细胞数量。体外及体内实验也表明GIT1通过调控Notch信号，在控制乳腺肿瘤生长发育中发挥着关键作用。GIT1可作为ER（−）乳腺癌的预后评估的分子生物学指标。已有众多Notch信号通路抑制剂尝试治疗肿瘤的研究，本研究为此类研究提供了新的线索。

然而，GIT1作为细胞内普遍存在的衔接分子，影响众多分子信号通路。例如，GIT1与NF-κB通路NEMO及Notch下游分子RPB-J结合，调控骨髓间充质干细胞的血管生成因子分泌和决定柄细胞命运，促进血管生成[19,20]。GIT1在肿瘤生物学中的功能也是多样的。GIT1刺激肺癌，口腔鳞状细胞癌，肝癌和结肠癌等的生长，侵袭和转移，这些癌症种类也都与Notch相关[6,21−24]。有报告从小鼠尾静脉注射具有高度转移特性的乳腺癌细胞群落，抑制GIT1表达可减少细胞迁移，侵袭及淋巴结转移[25]。在乳腺癌细胞的原发生长和转移中，GIT1似乎具有不同功能。

总之，本研究揭示了GIT1−Notch结合反应在ER（−）乳腺癌中的作用。此结合如何影响其它类型肿瘤的发生发展，仍然有待探讨。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-28631-y

瑞典卡罗林斯卡医学院Per Uhlén实验室张松柏博士为论文第一作者，Per Uhlén教授为论文通讯作者。Per Uhlén教授团队其他成员，瑞典卡罗林斯卡医学院医院John Inge Johnsen研究员及其团队成员，芬兰图尔库大学Cecilia Sahlgren教授及其团队成员，上海科技大学御子柴克彦教授也合作参与了该项研究。

第一作者张松柏（后排右一）；通讯作者Per Uhlén（前排）；合作作者御子柴克彦（后排左一）。 

（照片提供自：瑞典卡罗林斯卡医学院Per Uhlén团队）

往期文章精选

参考文献（上下滑动查看）  

1. Ferlay, J. et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int. J. Cancer 127, 2893–2917 (2010).

2. Andersson, E. R. & Lendahl, U. Therapeutic modulation of Notch signalling—are we there yet? Nat. Rev. Drug Discov. 13, 357–378 (2014).

3. Lafkas, D. et al. Therapeutic antibodies reveal Notch control of transdifferentiation in the adult lung. Nature 528, 127–131 (2015).

4. Wu, Y. et al. Therapeutic antibody targeting of individual Notch receptors. Nature 464, 1052–1057 (2010).

5. Kopan, R. & Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell 137, 216–233 (2009).

6. Siebel, C. & Lendahl, U. Notch signaling in development, tissue homeostasis, and disease. Physiol. Rev. 97, 1235–1294 (2017).

7. Huenniger, K. et al. Notch1 signaling is mediated by importins alpha 3, 4, and 7. Cell Mol. Life Sci. 67, 3187–3196 (2010).

8. Jeffries, S. & Capobianco, A. J. Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization. Mol. Cell Biol. 20, 3928–3941 (2000).

9. Dickson, B. C. et al. High-level JAG1 mRNA and protein predict poor outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 20, 685–693 (2007).

10. Pece, S. et al. Loss of negative regulation by Numb over Notch is relevant to human breast carcinogenesis. J. Cell Biol. 167, 215–221 (2004).

11. Reedijk, M. et al. High-level coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overall survival. Cancer Res. 65, 8530–8537 (2005).

12. Stylianou, S., Clarke, R. B. & Brennan, K. Aberrant activation of notch signaling in human breast cancer. Cancer Res. 66, 1517–1525 (2006).

13. Rizzo, P. et al. Cross-talk between notch and the estrogen receptor in breast cancer suggests novel therapeutic approaches. Cancer Res. 68, 5226–5235 (2008).

14. Simoes, B. M. et al. Anti-estrogen resistance in human breast tumors is driven by JAG1-NOTCH4-dependent cancer stem cell activity. Cell Rep. 12, 1968–1977 (2015).

15. Lee, C. W., Raskett, C. M., Prudovsky, I. & Altieri, D. C. Molecular dependence of estrogen receptor-negative breast cancer on a notch-survivin signaling axis. Cancer Res. 68, 5273–5281 (2008).

16. Speiser, J. et al. Notch-1 and Notch-4 biomarker expression in triple-negative breast cancer. Int J. Surg. Pathol. 20, 139–145 (2012).

17. Yao, K. et al. Notch-1 and notch-4 receptors as prognostic markers in breast cancer. Int J. Surg. Pathol. 19, 607–613 (2011).

18. Jin, S. et al. Non-canonical Notch signaling activates IL-6/JAK/STAT signaling in breast tumor cells and is controlled by p53 and IKKalpha/IKKbeta. Oncogene 32, 4892–4902 (2013).

19. Li, L. et al. GIT1 regulates angiogenic factor secretion in bone marrow mesenchymal stem cells via NF-kappaB/Notch signalling to promote angiogenesis. Cell Prolif. 52, e12689 (2019).

20. Majumder, S. et al. G-protein-coupled receptor-2-interacting protein-1 controls stalk cell fate by inhibiting delta-like 4-notch1 signaling. Cell Rep. 17, 2532–2541 (2016).

21. Chang, J. S. et al. GIT1 promotes lung cancer cell metastasis through modulating Rac1/Cdc42 activity and is associated with poor prognosis. Oncotarget 6, 36278–36291 (2015).

22. Huang, W. C. et al. miRNA-491-5p and GIT1 serve as modulators and biomarkers for oral squamous cell carcinoma invasion and metastasis. Cancer Res. 74, 751–764 (2014).

23. Peng, H. et al. MAT2B-GIT1 interplay activates MEK1/ERK 1 and 2 to induce growth in human liver and colon cancer. Hepatology 57, 2299–2313 (2013).

24. Weaver, A. N. et al. Notch signaling activation is associated with patient mortality and increased FGF1-mediated invasion in squamous cell carcinoma of the oral cavity. Mol. Cancer Res. 14, 883–891 (2016).

25. Chan, S. H. et al. MicroRNA-149 targets GIT1 to suppress integrin signaling and breast cancer metastasis. Oncogene 33, 4496–4507 (2014).

制版︱王思珍

本文完